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CARACTERIZACION MOLECULAR DE UNA FAMILIA DE ADN SATELITE
CENTROMéRICO DE LA DORADA
(Sparus aurata)
Esta práctica consta de dos partes:
PRIMERA
PARTE
Electroforesis en un gel de agarosa de
los fragmentos generados por la digestión de distintos enzimas de restricción
(EcoRI, PvuII, Dra I, SacI, HinfI y HindIII ) del ADN genómico de la dorada.
Posteriormente se realiza la transferencia del ADN a una membrana nylon
mediante la técnica de Southern-blot.
Se procederá de la siguiente forma:
Digestión de ADN genómico total con una batería de enzimas de restricción
1. Digerimos 5 microgramos de ADN genómico total, para ello mezclamos en un tubo eppendorf los siguientes reactivos:
- ADN: 5 microgramos
- Buffer (correspondiente para cada enzima): 1/10 del volumen total
- ARNasa: 5 microlitros
- Enzima de restricción: 5 unidades por microgramo de ADN a digerir
- Agua ultrapura: hasta 100 microlitros
2. Tras toda la noche de incubación en una estufa a
- Se añade 1/10 del volumen de acetato sódico y 2 volúmenes de etanol frío.
- Se incuba media hora a
- Centrifugamos 10 minutos a
- Descartamos el sobrenadante y lavamos el precipitado restante con etanol al 70%.
- Centrifugamos 5minutos a
- Descartamos el sobrenadante, dejamos secar el ADN precipitado y resuspendemos en agua ultrapura.
Electroforesis
Cargamos las digestiones en un gel de agarosa y las dejamos migrar a bajo amperaje durante toda la noche.
Transferencia a membrana de nylon
- El ADN presente en el gel de agarosa será transferido a una membrana
de nylon por medio del método de la transferencia alcalina. Esta transferencia a membrana se realizará utilizando un dispositivo especial que puede ser
acoplado a una bomba de vacío y permite el flujo de soluciones y de ADN desde
el gel de agarosa a la membrana de nylon. En la cubeta de vacío, colocamos una
máscara de plástico y practicamos unas incisiones
del tamaño justo del gel. Colocamos una membrana de nylon con las mismas dimensiones, sobre la
que colocamos en estrecho contacto el gel de
agarosa que contiene nuestras digestiones. Una vez hecho esto, montamos el dispositivo y lo conectamos a
una bomba de vacío y comenzamos a añadir las
distintas soluciones que vamos a emplear.
- Dado que algunos fragmentos de ADN
pueden ser mayores de 15 kb, es recomendable llevar a cabo una depurinación,
que en último extremo rompe las cadenas de ADN en fragmentos menores y por
tanto permite una transferencia más eficiente.
Solución de Depurinación (15 minutos)
-
A continuación se reemplaza
la solución de depurinación por una solución alcalina
que desnaturaliza las dobles cadenas de ADN. Esto permitirá la posterior
unión del ADN (cargado negativamente) a la membrana de nylon (con
carga positiva). Además, el ADN queda en forma de cadena simple,
lo que permite la posterior hibridación de las sondas marcadas que
queremos localizar, así como la eliminación de cualquier resto
de ARN que pudiera aún quedar en la muestra.
Solución de Desnaturalización (15 minutos)
-
A continuación descartamos cualquier
tipo de residuo anterior o restos de agarosa mediante la solución
de neutralización.
Solución de Neutralización (15 minutos)
pH 7.5
-
Finalmente se procede a la transferencia
definitiva del ADN en la membrana de nylon.
Solución de transferencia (1 hora)
20xSSC
-
Es crucial en este último paso
hacer una fijación permanente del ADN a la membrana, de tal forma
que no se pierda durante las siguientes manipulaciones. Para ello se puede
recurrir a un choque térmico, someter la membrana a rayos ultravioleta
o, preferiblemente fijarla con una solución de NaOH.
Solución de Fijación
(2 minutos)
5M NaOH
-
Para terminar, lavamos la membrana en 5xSSC durante 1 minuto
y una vez seca la guardamos para los siguientes procedimientos.
SEGUNDA PARTE
Hibridación sobre la membrana con una
sonda constituida por una unidad monomérica de la familia de ADN
satélite EcoRI del centrómero de los espáridos (clon pSa19). Para llevar a cabo la
hibridación, se marca la sonda mediante el sistema ECL Gold (Amersham). El
marcaje consiste en conjugar la sonda con moléculas de la enzima peroxidasa.
Posteriormente, tras una noche de incubación, se procede al lavado de la
membrana y la detección quimioluminiscente de la hibridación.
Se procederá de la siguiente forma:
Marcaje
de la sonda e Hibridación
1. Introducir la membrana en una
botella de hibridación y realizar una prehibridación durante una hora a
2.
Transcurrido este tiempo añadir la sonda marcada directamente
sobre el tampón de hibridación sin tocar la membrana. Poner en total 100 ng de
sonda (10 ml de una solución de 10 ng/ml de sonda)Incubar toda la noche a
Durante el
periodo de la prehibridación , se procede a marcar la sonda
de la siguiente forma:
1. De una solución de sonda 10 ng/µl, pasar 10 µl a un microtubo eppendorf nuevo.
2. Desnaturalizar la sonda: introducir el microtubo en un baño a temperatura de ebullición. Mantener 10 minutos.
3. Pasar el microtubo a hielo durante 5 minutos.
4. Centrifugar 30 segundos.
5. Añadir 1 volumen de REACTIVO DE MARCAJE (complejo de peroxidasa cargado positivamente).
6. Añadir 1 volumen de solución de GLUTARALDEHIDO.
7. Agitar para mezclar y centrifugar 30 segundos.
8.
Incubar a
9. Añadir la sonda marcada a la botella de
hibridación.
Lavado de la membrana y detección
LAVADO DE
1. Pasar la membrana a una bandeja con 200 ml de la primera solución de lavado:
-
- 25 ml de 20xSSC
- Completar hasta un litro con agua
destilada.
2.
Cubrir la membrana e incubar con agitación a
3. Repetir el lavado del paso 1 durante 10 minutos más con solución nueva.
4. Pasar la membrana a una bandeja nueva con 200 ml de 2xSSC.
5. Cubrir la membrana e incubar a temperatura ambiente y con agitación durante 5 minutos.
6. Repetir el lavado del paso 4 durante otros 5 minutos con 2xSSC de nuevo.
DETECCIóN DE
1. Mezclar 5 ml de REACTIVO DE DETECCION Nº1 (H2O2) con 5 ml de REACTIVO DE DETECCION Nº2 (Luminol).
2. Pasar la membrana a una bandeja limpia e incubar durante 1 minuto exacto con la solución de detección (a temperatura ambiente).
3. Pasar la membrana a un cassette de exposición de Rayos X entre dos plásticos y colocar en oscuridad una película HyperfilmTM ECL (Amersham) sobre ella.
4. Cerrar el cassette y esperar unos 30 minutos.
5. Transcurrido este tiempo, en oscuridad, revelar la película con revelador de fotografía (dilución 1/10) y fijar con fijador de fotografía (dilución 1/4).
6. Analizar los resultados.
CRONOGRAMA
PRIMER DÍA
- Las digestiones previamente realizadas se cargarán en un gel de agarosa y se dejarán migrar durante unas 6-8 horas.
- A continuación se procede a la transferencia del ADN a la membrana de nylon.
- Marcaje de la sonda e hibridación durante toda la noche.
SEGUNDO DÍA
- Lavado de la membrana, revelado y análisis de los resultados.