Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

 

 

         La técnica de amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que consiste en la amplificación in vitro de un fragmento de ADN específico. Para llevar a cabo el experimento de amplificación es necesario conocer, al menos parcialmente, la secuencia del fragmento a amplificar (un gen, una parte de un gen, una región no codificadora,...). Básicamente, se trata de replicar una y otra vez un mismo fragmento de ADN y, para ello, debemos realizar in vitro lo que hacen las células in vivo para replicar su ADN.

 

Así, se trata de disponer en un tubo de ensayo el ADN de la especie objeto de estudio. Además debemos añadir en dicho tubo un par de oligonucleótidos que actúen como cebadores para la ADN polimerasa. La elección de estos oligonucleótidos (cebadores o primers) es crucial dado que han de delimitar la región a amplificar. En concreto, deben ser complementarios a cada uno de los extremos 3´ de la región a amplificar:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


En este esquema se dibuja en la parte superior una molécula de ADN y se delimita

la región que ha de ser amplificada (flechas verticales). En la parte inferior se destacan

los sitios de apareamiento de los primers utilizados (flechas horizontales) y la

orientación de éstos.

 

Además del ADN y de los primers, es necesario añadir al tubo de reacción los 4 tipos de desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTPs) que componen el ADN (dATP, dGTP, dTTP y dCTP, en una mezcla equimolar de cada uno de ellos). Por supuesto, añadiremos por último también la ADN polimerasa que, en este caso, ha de ser una polimerasa especial capaz de resistir las elevadas temperaturas a la que vamos a someter a nuestro tubo de reacción. Dicha ADN polimerasa es la llamada Taq-polimerasa, aislada de la bacteria Thermus aquaticus.

 

Una vez tenemos todos los componentes en nuestro tubo de reacción (Figura 1), tenemos que favorecer de alguna forma que ocurra la síntesis de ADN. Para ello, lo primero que debemos hacer es facilitar la desnaturalización del ADN. A continuación, permitir el alineamiento de los primers (apareamiento con su región complementaria) y, por último, facilitar que la polimerasa lleve a cabo la síntesis de ADN utilizando como cebadores los extremos 3´ de los primers utilizados. Así, nuestra reacción constaría de 3 pasos:

 

1. Desnaturalización. Se conseguiría elevando la temperatura del tubo de reacción hasta 94oC, durante, por ejemplo, un minuto (este tiempo puede variar entre ½  minuto y 2 minutos)

 

2. Alineamiento. Se desciende la temperatura hasta una temperatura que puede oscilar entre 40 oC y 60 oC (dependiendo de diversos parámetros como la secuencia de los primers, su especificidad,...). La duración de este paso puede oscilar entre ½ minuto y 2 minutos.

 

3. Extensión. Se vuelve a aumentar la temperatura hasta los 72 oC y se deja actuar a la Taq polimerasa durante 1 ó 2 minutos.

 

 

Estos tres pasos constituyen un ciclo. La repetición de este ciclo unas 40 veces, por ejemplo, permite obtener, como resultado de un experimento de amplificación, millones de copias del fragmento de interés.

 

Todo esto, por supuesto, se realiza de forma automatizada. Para ello, los tubos de reacción se introducen en un termociclador que de forma automática realiza los 40 ciclos de amplificación.