Extraccion de ADN

3.1.- Materiales

Viales de vidrio para congelar micelio;Tubos de centrífuga de polipropileno de 10, o 15 o 20 ml ; Baños de agua (65º C, 37ºC); Centrífuga refrigerada (5000 rpm., 10000 rpm) ;Tubos eppendorf de 1,5ml.;Guantes; Micropipetas; Puntas azules y amarillas estériles; Campana de extracción de gases al fenolizar; Desecador a vacío; Hielo

Reactivos

N2 liquido; Tampón HSE esterilizado por filtración; SDS 10% ;[TE] : Tris 50mM pH 8, EDTA 20mM pH 8, autoclavar. ;TE : Tris 10mM pH 8, EDTA 1mM pH 8, autoclavado ;Fenol: cloroformo: Alcohol isoamílico (25:24:1) ;Acetato sódico 3M ajustado a pH 6.0 con ácido acético glacial. Autoclavar; Isopropanol; Etanol 70%; RNasa libre de DNasa solución madre de 10mg/ml

3.2.- Método

3.2.a.- Extracción del ADN DE HONGOS FILAMENTOSOS

Preparación del micelio

 

1.- Disponer de micelio congelado a –80 oC

2- Pesar 200-400 mg de micelio congelado

3- Sumergirlo  en nitrógeno líquido unos minutos (cuando deja de hervir indica que  está congelado)

Romper el micelio para liberar el contenido intracelular

4 Introducir el micelio congelado en mortero de porcelana esterilizado.

 

5.- Añadir un poco de nitrógeno

 

6.-  Triturar con pistilo esterilizado. Reponer el N evaporado (tras cada adición hierve un poquito; esperar a que deje de hervir)

2- Disolver el contenido intracelular

Añadir HSE (1ml/100 mg de micelio). Mezclar poco a poco.

 

Pasar la suspensión a un tubo falcon (“sarstedt”)

 

Enfriar en hielo

 

Añadir SDS (0.1 volumen de SDS 10%).

 

Homogeneizar la suspensión invirtiendo suavemente y alternativamente el tubo

 

Incubar a 65 grados durante 15 minutos

 

Añadir un volumen de TE  concentrado (50mM Tris pH 8, EDTA 20mM pH 8). y volver a agitar suavemente por inversión.

3-precipitar y retirar proteínas

añadir fenol

 

Añadir la mezcla de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25/24/1) hasta obtener una fase acuosa limpia..

Centrifugar

Equilibrar los tubos. Centrifugar en frió tras  cada extracción (5000 rpm durante 5 minutos).

4 Recuperar el ADN.

Emplear puntas azules con extremo de 3mm de diámetro  (puntas normales cortadas):  para que  no se rompa el ADN al recoger la muestra.

El ADN Se encuentra disuelto en la fase acuosa (la superior). La fase orgánica inferior es de color amarillo debido a hidroquinoleina

 

La fase acuosa (la superior). Es menos densa que la fase orgánica, (cuando contiene menos de 0,5 M de sales o 10% de sacarosa). Utilizar pipeta automática.

 

Hacer una nueva extracción de la fase orgánica – interfase, agregando un volumen de [TE] pH 8. Centrifugar (5 min, 5000 rpm.)  Recuperar la fase acuosa y unirla a la anterior.

 

Repetir la extracción con fenol hasta que no se vea aire ocluido en la interfase.

 

Añadir un volumen de cloroformo. Mezclar suavemente. Centrifugar a 5000 rpm por 5 minutos, recuperar la fase acuosa con micropipeta usando puntas cortadas.

 

10.- Añadir 0,2 volúmenes de acetato sódico 3M pH 6,0. Mezclar.

5-lavar con isopropoanol

11.- Añadir 0,6 volúmenes de isopropanol. Mezclar muy suavemente. Dejar precipitar 1 hora a temperatura ambiente

6- Recuperar el ADN semipurificado

  1. Centrifugar a 10000 rpm, 10 minutos en frio.
  2. Lavar el precipitado con 500 ul de etanol 70%,.
  3. centrifugar a 10000 rpm, 5 min.
  4. Secar al vacio

Resuspender finalmente en  25ul,  50ul o 100 ul de H2O ultrapura estéril..

5 Eliminar impurezas de ARN

Añadir 1 ul de RNAsa libre de DNAsa de una solución madre 10 mg/ml. Incubar a 37ºC durante 30 min.