Pruebas del IMViC

Fundamento: Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer y Citratos

Son cuatro pruebas bioquímicas.Se emplean fundamentalmente para la identificación de las Enterobacterias (bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos con metabolismo fermentador). Dependiendo de las condiciones, las enterobacterias, pueden realizar un metabolismo aerobio (si disponen de oxígeno), realizar una respiración anaerobia (si hay nitratos u otro aceptor de electrones) y distintas fermentaciones.

                                             

Escherichia coli : Indol + ;Rojo de metilo +; Voges-Proskauer –;Citratos -

5.1. Producción de Indol (I)

5.1. Producción de Indol (I):

a-Fundamento: Se determina si la bacteria posee una enzima (triptofanasa). La triptofanasa hidroliza el triptófano  en  indol y alanina. El indol se detecta empleando un reactivo específico (Reactivo de Kovacs). El triptófano forma parte de las peptonas del medio.

 

b- Materiales y reactivos:Agua

 de peptona

y Reactivo de Kovacs

5.1.c- Método:

c- Método:      Inocular el medio de cultivo (agua de peptona). Incubar a 37 oC durante 48 horas     

 

Añadir unas gotas de reactivo de Kovacs. Agitar y dejar reposar el cultivo. El HCl proporciona el pH ácido que requiere la reacción. El alcohol amílico es, insoluble en agua y menos denso

5.1.d-Resultado: Producción de Indol

Un anillo rosa-rojizo en la superficie indica que se ha formado un complejo coloreado entre el indol y el p-dimetilamino benzaldehído.El alcohol amílico concentra el complejo coloreado en la superficie

A la izquierda se observa un cultivo de E. coli y a la derecha otro de Salmonella spp

5.2. Rojo de metilo (M)

5.2. Rojo de metilo (M)

5.2.a. Fundamento: Detecta la fermentación ácido-mixta. Se acumulan ácidos (acético, fórmico, etc.), relativamente fuertes y bajan el pH del medio hasta 4-5. Dicho cambio de pH se detecta añadiendo un indicador (rojo de metilo) al cultivo

 

b. Materiales y reactivos: Medio de Clark-Lubs e indicador de rojo de metilo

5.2.c. Método

Inocular el medio de Clark-Lubs. Incubar a 37 oC durante 48 horas.

Añadir unas gotas de rojo de metilo (rojo a pH 4-5; amarillo a pH>6)

5.2.d. Resultado. Rojo de Metilo

 

A la izquierda un cultivo de E. coli y a la derecha otro de Serratia

5.3. Voges-Proskauer (V)

Fundamento

         Detecta la fermentación butanodiólica. En esta  fermentación se producen menor cantidad de ácidos que en la fermentación ácido-mixta, y una gran cantidad de butanodiol. Mediante un reactivo, (alfa-naftol y KOH al 40%), se detecta la presencia de un precursor del butanodiol (acetilmetilcarbinol o acetoína). La acetoina en presencia de oxígeno se oxida a diacetilo. El diacetilo oriigina una coloración roja al reaccionar con los restos guanidínicos de algunos aminoácidos de la peptona del medio (Ej. Arginina).

 

b. Materiales y reactivos: El medio de cultivo, es el mismo que en la prueba del rojo de metilo. Reactivos :alfa-naftol

5.3.c. Método

Inocular el medio de Clark-Lubs. Incubar a 37 oC durante 48 hora

Añadir unas gotas alfa-naftol (0.6 ml). Agitar y añadir KOH (0.2 ml).Agitar. Iincubar 1-2 horas a 37 oC

5.3.d.Resultado: Voges-Proskauer

La acetoína en contacto con el oxígeno y la potasa origina diacetilo. El alfa naftol incrementa la sensibilidad de la reacción. El diacetilo origina un compuesto de color rosado.La prueba será positiva si en 20 minutos aparece una coloración roja. Los cultivos negativos se incuban 1-2 horas a 37 oC en posición inclinada efectuándose de nuevo la lectura. (El contacto con el oxígeno y la elevada temperatura favorecen la reacción).

A la izquierda cultivo de Serratia spp. Y a la derecha de E. coli

5.4. Consumo de citratos (C)

Fundamento:         Se determina la utilización del citrato como única fuente de carbono y energía. La prueba emplea un medio definido (Koser) con citrato como única fuente carbonada (se detecta turbidez). Alternativamente se utiliza el medio de Simmons: utiliza un medio sólido con citrato sódico y un indicador ácido-base (azul de bromotimol). En este caso se detecta la alcalinización del medio por el consumo del citrato.

 

 Materiales y reactivos: Medio de Koser o Medio de Simmons

5.4.c. Método

Inocular uno de los medios:El medio de Simmons es sólido, y se siembra por estría con asa de platino. Incubar a 37 oC durante 48 horas

5.4.d. Resultado: Crecimiento sobre citrato como unica fuente de carbono

Detectar el crecimiento en el medio de Koser por turbidez. En el medio de Simmons por alcalinización del cultivo (el indicador toma color azul)

Crecimiento en el medio de Simmons: a la izquierda cultivo de Salmonella  spp. y a la derecha de E. coli. *Dado que la lectura del medio de Koser se hace detectando la turbidez del medio, es necesario inocular con una pequeña cantidad de bacterias y comprobar que el tubo permanece casi transparente tras la inoculación.