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	Microbiología aplicada: Recuperación de un suelo contaminado por petróleo
I. INTRODUCCIÓN	El interés por el destino de los residuos del petróleo es relativamente reciente. Las necesidades de una sociedad cada vez más consumista, han llevado a un crecimiento de la industria petroquímica con un fuerte impacto sobre la calidad del ambiente La contaminación por petróleo suelen tener gran repercusión sociológica cuando es de carácter masivo. Sin embargo, la proximidad cotidiana a la contaminación por petróleo no tiene su origen en estos episodios escandalosos. Nuestro uso energético cotidiano, las redes de almacenaje y distribución de los productos energéticos, probablemente nos sitúan ante riesgos ambientales, no por desconocidos menos significativos. Tan es así que, son más frecuentes las actividades para descontaminar ambientes desconocidos por la opinión pública, que aquellos contaminados en episodios de mayor significación mediática.
I.1 El petróleo	I.1 El petróleo El petróleo es una mezcla compleja de gases, líquidos y sólidos. Los componentes mayoritarios son los hidrocarburos (HCs). Además contiene algunos metales (hierro, níquel, vanadio y otros). Los HCs suelen distribuirse por su tamaño molecular en varias fracciones. La más pesada está representada por fracciones de 22 a 40 átomos de carbono (Fracción C₂₂-C₄₀).
Hidrocarburos	Los hidrocarburos son de origen biológico o antrópico. Los HCs biogénicos son sintetizados por plantas, animales y microorganismos. A los HCs biogénicos se les unen los de origen industrial como los del refino de petróleo (separación por destilación de sus componentes). Los HCs antrópicos más significativos son los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs; “Polycyclic Aromatic Hidrocarbons”), los sustituidos con sulfuro o nitrógeno y sus homólogos alquilicos. Muchos PAHs son estables y tóxicos (los hay carcinógenos y mutagénicos, como se explica más abajo). Los PAHs están formados por dos ó más anillos de benceno fusionados en disposición lineal, angular o “agrupada” como han sido descritos por Cerniglia (1997) y se diferencian por el número y posición de sus anillos. Suelen distribuirse en dos clases: PAHs de bajo peso molecular (de dos a tres anillos aromáticos) como el naftaleno, fluoreno, fenantreno, antraceno y derivados, y PAHs de alto peso molecular (de 4 a 7 anillos aromáticos, fracción C₂₂-C₄₀) como el criseno. Los efectos biológicos de los PAHs están relacionados con su tamaño y estructura, que condicionan sus propiedades físicas y químicas y, por tanto su distribución en la naturaleza. Los PAHs de alto peso molecular son relativamente inmóviles, de baja volatilidad y solubilidad en agua. Los efectos cancerígenos de dieciséis PAHs los definen como contaminantes prioritarios por la Organización Mundial de la Salud y por la Unión Europea (naftaleno, acenaftileno, acenafteno, fluoreno, fenantreno, antraceno, fluoranteno, pireno, benzo(a)antraceno, criseno, benzo(b)fluoreno, benzo(k)fluoreno, benzo(a)pireno, indeno(1,2,3-cd)pireno, dibenzo(ah)antraceno y benzo(ghi)perileno). Los PAHs se encuentran distribuidos en el suelo y subsuelo debido principalmente a los derrames de petróleo en la industria petroquímica, y al aporte atmosférico. La fuente principal de PAHs es la combustión incompleta de combustibles fósiles, de residuos forestales y agrícolas o por derrames de petróleo.
I.2. Descontaminación del suelo	I.2. Descontaminación del suelo (bioreparacón, biodegradación, cometabolismo, mineralización y recalcitrancia) La bioreparación (“bioremediation”) es una tecnología de tratamiento de la contaminación que utiliza los sistemas biológicos para mineralizar o transformar los contaminantes y es un concepto que ha entrado por derecho propio en los textos científicos. La bioestimulación (adición de nutrientes y la aireación), el bioaumento (adición de microorganismos) y el registro de la biodegradación natural (bioreparación intrínseca) son los tres procesos incluídos en el concepto de bioreparación del suelo.
Degradación microbiana	La biodegradación es el resultado de la metabolización. El suelo tiene una capacidad intrínseca de bioreparación en la que participan los microorganismos. En suelos con malas condiciones para el desarrollo microbiano, la bioreparación intrínseca decrece. Es posible encontrar mezclas de hidrocarburos prácticamente inalteradas tras 25 años de la contaminación de suelos con malas condiciones para el desarrollo microbiano (muy contaminados, con escasos nutrientes y bajas temperaturas). La conclusión es que los microorganismos participan de la biorepación intrínseca de los suelos
Microorganismos: eucariotas/procariotas	Aunque los eucariotas del suelo pueden participar en la degradación, algunas bacterias, son las de mayor participación en la degradación de los HCs de suelos contaminados por petróleo. Algunos hongos obtenidos de suelos contaminados por petróleo, pueden degradar ciertos PAHs en condiciones controladas de laboratorio. No obstante, tras la contaminación del suelo por petróleo, hay un cambio desde una microbiota eucariota hasta otra procariota gram-negativa, determinando la prevalencia de ciertos genotipos gram negativos .
Biodegradabilidad: cambios enzimáticos y no enzimáticos	La biodegradabilidad de una molécula (orgánica o inorgánica) representa su susceptibilidad a la alteración por microorganismos. Esta alteración microbiana puede ser el resultado de procesos no enzimáticos o enzimáticos. Los no enzimáticos derivan de la acción del metabolismo o metabolitos microbianos que producen cambios geoquímicos (como consumo de O₂, modificaciones de pH o acumulación de subproductos metabólicos). Los enzimáticos incluyen: procesos que pueden resultar en un mejor crecimiento microbiano (por ejemplo usando la molécula como fuente de energía), procesos que detoxifican el medio (por ejemplo facilitando la lixiviación de tóxicos inorgánicos de la vecindad de las células) o procesos que no ofrecen beneficio aparente al microorganismo que los promueve. Entre estos últimos se encuentra la biodegradación por cometabolismo.
Cometabolismo	El término cometabolismo se utiliza con una doble definición: i) proceso desarrollado fortuitamente por enzimas que son inducidas por una molécula diferente de aquella que se metaboliza, ii) procesos en los que los miembros de una comunidad microbiana metabolizan los subproductos metabólicos de otros. En condiciones naturales pues, no siempre es posible atribuir la biodegradación de una molécula a un grupo de microorganismos concretos.
Mineralización/alteración	Por otro lado, la biodegradación puede implicar la mineralización de la molécula, o solamente su alteración estructural. En ambientes aerobios la alteración estructural resulta en acumulación de moléculas parcialmente oxidadas más hidrosolubles y la mineralización en el desprendimiento de CO₂ y H₂O. Por regla general las moléculas ramificadas o con anillos polinucleares son más resistentes a la biodegradación. A continuación se resume la biodegradación de los hidrocarburos del petróleo diferenciándolos en alcanos, PAHs y compuestos alicíclicos.
Degradación de alcanos	La biodegradación de los hidrocarburos del petróleo depende además de su estructura de su tamaño molecular. Los alcanos de cadena corta son tóxicos a muchos microorganismos y relativamente difíciles de degradar, los n-alcanos de longitud intermedia (C₁₀-C₂₄) se degradan más rápidamente. A medida que se incrementa su tamaño son más resistentes a la biodegradación hasta que dejan de ser utilizados como fuente de carbono a tamaños superiores a 500. La degradación de alcanos se inicia por oxigenasas (mono- o di-oxigenasas), que rinden usualmente alcoholes primarios, los cuales son secuencialmente oxidados hasta ácidos, que suelen reducir su tamaño por b-oxidaciones sucesivas
Degradación de aromáticos	Los anillos aromáticos, especialmente los de tipo polinuclear condensado, como los PAHs del petróleo se degradan más lentamente que los alcanos, algunos con mucha dificultad y algunos en absoluto. Una de las razones de su recalcitrancia (escasa o nula biodegradación) es que frecuentemente su biodegradación es cometabólica por enzimas inducidas por aromáticos de menor tamaño. En condiciones aerobias su biodegradación es iniciada también por dioxigenasas, producen catecoles, que permiten la rotura sucesiva de los anillos aromáticos hasta intermediarios metabólicos comunes. Otras veces se acumulan los dioles producidos o sus productos de oxidación hasta dar metabolitos tóxicos, como durante la oxidación de bifenilos clorados, o PAHs. Los PAHs adquieren efecto mutagénico durante su biotransformación. En eucariotas los PAHs se oxidan sucesivamente por citocromo P₄₅₀ monoxigenasas, hasta formar dihidrodiol-epóxidos que alquilan el ADN. El cometabolismo de estos productos de transformación por componentes diferentes de las comunidades microbianas ha sido demostrado en algunos casos. Los compuestos alicíclicos frecuentemente no son utilizados como única fuente de carbono, a no ser que presenten una cadena alifática suficientemente larga. Frecuentemente su degradación es también cometabólica.
Bioestimulación y “landfarming”	Bioestimulación y “landfarming” El éxito de la bioreparación depende de tres factores: i) la biodegradabilidad del contaminante específico, ii) de la comunidad microbiana que la ha de desarrollar y iii) del ambiente. La manipulación del suelo para acelerar su descontaminación se incluye bajo el concepto de “laboreo del suelo” (“landfarming”). La bioreparación por bioaumento, (inoculación del suelo con cultivos especializados) suele ser eficaz cuando se realiza en condiciones controladas de laboratorio, pero en condiciones reales “de campo”, su significación está controvertida. Más clara es la aceleración de la biodegradación de HCs por modificación del ambiente (adición de nutrientes), por bioestimulación, que por inoculación de microorganismos degradadores, aún siendo autóctonos del propio suelo contaminado. Hasta hace pocos años y probablemente hasta hoy la mayoría de las bioreparaciones se han aplicado a lugares contaminados por HCs y dependen de los microorganismos autóctonos. En la bioestimulación se corrigen las condiciones ambientales promoviendo un enriquecimiento espontáneo de los microorganismos apropiados para la degradación de los HCs. A continuación se resumen las necesidades de oxígeno molecular y de nutrientes para promover la bioestimulación. Algunas moléculas recalcitrantes, como los bifenilos policlorados, o algunos PAHs son degradadas aerobia y anaerobiamente pero la degradación de HCs depende fundamentalmente de la disponibilidad de oxígeno molecular. El incremento de O₂ se consigue mejorando el drenaje del suelo, añadiendo peróxido de hidrógeno, o ventilando el suelo o agua subsuperficiales (“bioventing” y “biosparging”), añadiéndole en ocasiones nutrientes o calentando mediante radiaciones. El incremento de la biomasa requiere nitrógeno y fósforo, por lo que su disponibilidad en el ambiente contaminado limita frecuentemente la biodegradación. Varias formulaciones de ambos nutrientes han sido comercializadas con esta finalidad, en ocasiones con aplicaciones muy particulares, incluso acompañadas de microorganismos (para promover el bioaumento) o la biodisponibilidad con tensoactivos (o microorganismos que los producen) .
	Un problema añadido es que frecuentemente un contaminante es degradado rápidamente cuando llega al suelo, pero paulatinamente su degradación disminuye y eventualmente se detiene, aún cuando las condiciones sean aparentemente favorables para la degradación. Este fenómeno se atribuye a la disminución de la biodisponibilidad del contaminante, depende de su propia naturaleza, de la presencia de otros contaminantes que le acompañan y del tiempo transcurrido desde la contaminación. La disminución de la biodisponibilidad es frecuente en vertidos antiguos de petróleo.
Microorganismos en suelos contaminados por hidrocarburos	Grandes grupos de microorganismos en suelos contaminados por hidrocarburos El resultado de la evolución es un mundo microbiano capaz de explotar virtualmente todas las fuentes metabólicas naturales de la Tierra (y muchas de las sintéticas) para su crecimiento y supervivencia. Así el crecimiento y la supervivencia microbiana dirigen los ciclos biogeoquímicos de los elementos, manteniendo simultáneamente las condiciones para la vida de otros habitantes de la Tierra. Los microorganismos que degradan hidrocarburos pueden o no ser cultivables en las condiciones artificiales de los laboratorios.
microorganismos no cultivables: hidrólisis de acetato de fluoresceína.	a) estimación de microorganismos no cultivables La caracterización de las comunidades degradadoras de hidrocarburos es un reto microbiológico pendiente de resolución en varios aspectos. La mayoría de especies (90-99%) que forman comunidades degradadoras de HCs no forman colonias cuando crecen en medios ordinarios de laboratorio. Parte de las razones para esta ausencia de crecimiento en medios artificiales de laboratorio se encuentra en la consideración hecha más arriba sobre la biodegradación. Otras razones residen en las propiedades de superficie de las células que metabolizan sustratos de escasa solubilidad, y en la toxicidad de los contaminantes o la de sus productos de transformación. La participación de microorganismos no cultivables en la pérdida de hidrocarburos del suelo se ha puede estimar mediante la hidrólisis del diacetato de fluoresceína (FDA). La incapacidad de crecimiento ha determinado el empleo de diferentes alternativas para cuantificar estos microorganismos degradadores no cultivables, como son ciertas pruebas genéticas, los cambios en el potencial redox de los cultivos, en el perfil de biomarcadores lipídicos recuperados del suelo o en la cuantificación de la hidrólisis del FDA. En esta práctica se utiliza la hidrólisis del FDA para cuantificar la actividad biológica en el suelo. En las soluciones de FDA solo fluorece la fluoresceína liberada metabólicamente, por lo que se puede cuantificar la actividad biológica total del suelo, midiendo A_{439 nm} de las soluciones de FDA obtenidas tras incubación con el suelo.
estimación de microorganismos cultivables	b) estimación de microorganismos cultivables El cultivo microbiano sobre diferentes sustratos se ha relacionado con la contaminación y bioreparación de suelos. En esta práctica se ha realizado el recuento de microorganismos heterótrofos totales por siembra en masa en agar nutritivo y por siembra en superficie en medio de Stanier. Por el número mas probable se realiza el recuento de microorganismos cultivables sobre un alcano alifático (n-hexadecano), sobre dos mezclas artificiales de PAHs, y sobre tres “crudos de petróleo” para determinar los microorganismos que pueden crecer sobre las mezclas más complejas de hidrocarburos.