Métodos

Evaluación de la calidad microbiológica del agua: Cuantificación e identificación de bacterias.

 Los autores agradecen al personal del Laboratorio de Control de Calidad de EMASAGRA su colaboración en la realización de esta página.

Pruebas Microbiológicas para el diagnóstico de la calidad del agua

La legislación garantiza la calidad del agua a través de varias pruebas. La calidad de las aguas destinadas al consumo humano está definida por la Directiva 80/778 CEE. Esta norma indica los parámetros microbiológicos que incluyen: la concentración de microorganismos aerobios mesófilos totales, de coliformes (totales y fecales), de estreptococos fecales y de Clostridium sulfitorreductores. Así mismo indica que las aguas no deben contener microorganismos patógenos en particular Salmonella, Staphylococcus, bacteriofagos fecales ni enterovirus. Las pruebas de mayor uso cuantifican en el agua organismos indicadores de contaminación fecal, no pretenden identificar microorganismos patógenos. Los métodos que aquí se describen lo son por filtración a través de membranas estériles.

Toma de muestra:

La muestra debe ser recogida en condiciones de esterilidad. Debe ser analizada lo antes posible o conservarla a 4ºC (menos de 24 horas).

Recuento de aerobios mesófilos totales

Hay dos métodos para la cuantificación de aerobios mesófilos totales: el método del número más probable (NMP) y el método del filtro de membrana (MF)  . En el recuento de microorganismos en alimentos , encontrarás un tercer método, basado en la inoculación de diluciones de alimentos. La habitual escasa concentración de microorganismos en agua impide la utilización directa de diluciones del agua para su análisis

 

El medio de cultivo para el recuento de mesófilos totales en ambos casos es peptona-extracto de levadura-glucosa y agar.

Filtración por membrana

-Se filtran100 ml de agua a través de una membrana estéril que retiene las bacterias.

- La membrana se coloca sobre el medio de cultivo  y se incuba a 37ºC durante 24-48 horas. Las células viables depositadas sobre el filtro originarán colonias.

Si se sospecha que el agua contiene un alto número de bacterias es conveniente diluir la muestra antes de la filtración.

Para facilitar la operación se dispone de dispensadores continuos de filtros estériles de varios fabricantes.

Recuento de coliformes totales y fecales por filtración en membrana

Desde el punto de vista técnico la diferencia entre coliformes totales (crecimiento a 37ºC ) y coliformes fecales (crecimiento a 44ºC ) es solamente la temperatura de incubación. Los conceptos teóricos se encuentran en esta pagina  

Los coliformes son usados como indicadores de calidad de agua por dos razones: 1- se encuentran en gran número en intestino de animales y humanos por lo que proceden de la misma fuente que muchos patógenos: heces. 2-Los tests para coliformes son relativamente simples y mas baratos que los tests para todos los patógenos intestinales. La presencia de cualquier coliforme indica posible contaminación del agua con organismos productores de enfermedades.

El medio de cultivo utilizado es Agar-lactosa con Tergitol R  (Tergitol 7 ,T7)

Medio Agar-lactosa con Tergitol R 

Es un medio selectivo y diferencial para aislamiento y recuento de coliformes de agua y  alimentos. El Tergitol-7: es un  inhibidor de bacterias Gram positivas. El Indicador (azul de bromo timol) permite detectara la fermentación de la lactosa.

  • Peptona de caseína:  5.0g
  • Extracto de Levadura. 3.0g
  • Lactosa: 10.0g
  • Tergitol 7: 0.1g
  • Azul de bromotimol: 0.025g
  • Agar:15g
  • pH: 6.9 ± 0.2

Esterilización 121ºC 15 min. Composición por litro

 

Filtrar 100 ml de agua a través del filtro de membrana

coliformes totales

Incubar el filtro sobre placas de Tergitol agar  a 37ºC 

Lectura: Los fermentadores de la lactosa: colonias amarillas, amarillas con centro naranja o rojo ladrillo y halo amarillo. Los no fermentadores de la lactosa colonias azules

coliformes fecales

Incubar el filtro sobre placas de Tergitol agar  a 44ºC:

 Lectura: Las colonias de E. coli: colonias de color amarillo rodeadas de halo amarillo

Recuento de estreptococos fecales ( enterococos)

La presencia de enterococos en aguas indica una contaminación mas remota que la detectada copn la polimetría. Una de las mejores descripciones de enterococos se encuentra en esta pagina

 

 

Filtrar 100 ml de agua. Depositar el filtro sobre placas del medio de Slanetz y Bartley

Incubar a 37 oC durante 48 horas

Las colonias de estreptococos aparecen de color rojo

Medio Slanetz y Bartley

Es muy selectivo para detección y recuento de enterococos intestinales por el método de filtración de membrana.

Contiene Azida sódica que inhibe toda la microbiota Gram negativa. como indicador usa el cloruro de trifeniltetrazolio: es reducido por los enterococos produciendo un precipitado rojo insoluble.

Las colonias de enterococos aparecen de color rojo ladrillo.

  • Extracto de levadura:  5.0g
  • Glucosa: 2.0g
  • Azida sódica: 0.4g
  • Na2HPO4:4.0g
  • Cloruro de trifenilterazolio:0.1g
  • Triptosa:20.0g
  • Agar:  10.0g

Calentar  a ebullición no sobrecalentar no esterilizar en autoclave.Composición por litro

Recuento de Clostridium sulfitorreductores

Los clostridios son bacterias esporuladas, que por tanto tienen una gran persistencia en el agua, Se eliminan las células vegetativas por calentamiento y se detecta crecimiento de bacterias que reducen el sulfito,. La reducción del sulfito se detecta por ennegrecimiento del cultivo (SPS Agar). Buena información de los clostridios está depositada el siguiente enlace

Calentar la muestra a 80ºC durante cinco minutos. Inocular 2 ml de medio con 20 ml de muestra. Incubar a 37ºC 48 horas

Las colonias de sufitorreductoras (imagen) aparecen de color negro debido a la formación de SFe por la reducción del sulfito a SH2

SPS Agar

Sulfato de polimixina y Sulfadiazina son antibacterianos. El Indicador de la reducción del sulfito sódico es el citrato férrico. El medio se dispensa en tubos de gran volumen (ver inoculación), 2 ml por tubo, se esteriliza y se mantiene a 50ºC hasta su inoculación.

  • Peptona de caseina: 15.0g
  • Extracto de levadura: 10.0g
  • Citrato férrico:  0.5g
  • Sulfito sódico;   0.5g
  • Sulfato de polimixina B 0.01g
  • Sulfadiazina sódica 0.12g
  • Agar:  13.9g

Composición por litro

Recuento e identificación de Salmonella  

La versatilidad y ubicuidad de Pseudomonas se describe exhaustivamente en la página que se indica y dos capítulos afines .

El método utiliza el cultivo de los filtros sobre dos medios de cultivo el Rambach-Agar y el Cetrimida Pseudomonas Agar

Rambach-Agar

Es un medio selectivo (el desoxicolato: inhibe a las bacterias Gram positivas) y diferencial para identificar a Salmonella no typhi. Aunque permite el crecimiento de enterobacteriaceas diferencia claramente a Salmonella : el medio detecta actividad β-galactosidasa (de enterobacterias), por lo que las colonias de  coliformes son de color azul/violeta. Otras enterobacteriaceas y bacterias Gram negativas  (Proteus, Pseudomonas, Shigella, S. Typhi, S. Paratyphi A forman colonias incoloras/amarillentas. Además Salmonella produce ácidos del propilenglicol que se detectan con el indicador acido-base (colonias rojas).

El medio de cultivo no se esteriliza; es suficiente la ebullición hasta fundir el agar (20-25 minutos para  250 ml y 35-40 minutos para un litro)

  • Peptona:  8.0g
  • Cloruro sódico:     5.0g
  • Desoxicolato sódico: 1.0g
  • Mezcla cromógena: 1.5g
  • Propilenglicol: 10.5g
  • Agar: 15.0g

Calendar en baño o por vapor fluente agitando. No esterilizar en autoclave. Composición por litro

Identificación de Pseudomonas

Filtrar el agua e incubar el filtro sobre Cetrimida Pseudomonas Agar base

Medio Cetrimida Pseudomonas Agar base

Medio selectivo (cetrimida) para Pseudomonas que permite la producción de  pigmentos fluorescentes (fluoresceína y piocianina)

  • Peptona de Gelatina:  20.0g
  • K2SO4:10.0g
  • MgCl2:1.4g
  • Cetrimida 0.03%:  0.3 g
  • Agar: 13.6g

pH final: 7.2 ± 0.2

Preparación: Suspender 45.3g en 1 litro de agua desionizada añadir 10 ml de glicerina, mezclar calentar a ebullición (distribuir) esterilizar a 121ºC 15 min.Composición por litro.

   

Las placas con los filtros se incuban a 35ºC 24 horas. Se observan las colonias. Cualquier crecimiento indica Pseudomonas.

Examinar bajo luz ultravioleta: colonias color amarillo verdoso son positivas para: P.aeruginosa, P. fluorescens, P.putida

Comprobación de la identificación de Pseudomonas de las colonias detectadas en la figura de la parte superior

Aislar (en TSA) ambos tipos de colonias detectadas en el cultivo sobre Cetrimida Pseudomonas Agar base.

Incubar 24h a 28ºC.

Tomando bacterias con un asa, suspender en solución ambas bacterias para la identificación.

Un tipo de colonia corresponde a Pseudomonas aeruginosa

Identificación con API 10S * y prueba de la oxidasa

 
 

Inocular los pocillos de la galería según recomendaciones del fabricante.

 
 

Colocar agua en la bandeja del fondo.

Incubar durante 24 h a 28 oC

Lectura de resultados

Los reactivos necesarios se muestran en la imagen

 

Diferenciación por consumo de citratos

 

Revelado de TDA: ambas bacterias negativas

 

Ninguna bacteria produce indol

 

En ningún cultivo se detectan nitritos

Detección de oxidasa: la bacteria que produce colonias grandes es positiva (izquierda). La que produce colonias de menor tamaño no produce oxidasa (imagen de la derecha).