LÍNEA DE INVESTIGACIÓN:

 

MECANISMOS DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR Y APOPTOSIS

 

1.- Mecanismos de la inducción de apoptosis en linfocitos T humanos.

 

El objetivo de esta línea de investigación es el análisis de las señales tempranas implicadas en la inducción de apoptosis tras la activación de los linfocitos T. Para ello hemos analizado el mecanismo de la apoptosis en células de una línea leucémica Jurkat de linfocitos T que expresan el receptor heterólogo muscarínico de tipo 1 (J- HM1-2.2), el cual está acoplado al metabolismo de fosfolípidos de inositol (PtdIns) mediante proteínas de unión a GTP, e independientemente de la activación de proteínas tirosin-quinasas. 

 

En células J-HM1-2.2, la activación del receptor muscarínico con el agonista carbacol es suficiente para inducir apoptosis. Igualmente, la activación en estas células del receptor para el antígeno (TCR) o la adición de drogas (ionóforos de calcio y thapsigargina) que incrementan el calcio intracelular, activan el proceso de la apoptosis. Estudios llevados a cabo en nuestro grupo han demostrado que la entrada de calcio desde el medio extracelular, la subida de la concentración de calcio intracelular, la estimulación de la fosfatasa calcineurina y la síntesis "de novo" de proteínas, son etapas necesarias en la inducción de la apoptosis mediada por la activación de receptores (TCR y HM1), pero no en la apoptosis inducida por las drogas. El mecanismo de la apoptosis inducida por la activación de los receptores TCR y HM1 implica al menos parcialmente, la participación del sistema Fas/Fas-L, ya que es bloqueada en la presencia de un anticuerpo anti-Fas antagonista. En cambio, la activación de apoptosis por ionóforo de calcio o thapsigargina no requiere la estimulación de Fas. Todos estos resultados indican que en linfocitos T existen al menos dos mecanismos de inducción de apoptosis: uno, a través de receptores acoplados al metabolismo del calcio, que implica la estimulación del par Fas/Ligando de Fas, y otro, activado por compuestos que provocan la movilización del calcio de depósitos intracelulares y que aparentemente sólo requiere el vaciado permanente de estos depósitos.  

 

En la actualidad estamos analizando, a nivel transcripcional, la expresión de los genes Fas y su ligando FasL. Para ello hemos clonado diversos fragmentos de la región 5' de ambos genes en el vector de expresión pXP2-luc. Con estos plásmidos estamos llevando a cabo experimentos de transfección y de activación del promotor en células Jurkat. 

 

2.- Mecanismos de activación celular y transmisión de señales

 

    La línea principal de investigación del laboratorio es el estudio de la transducción de señales y la utilización de las moléculas señalizadoras como posibles dianas terapéuticas, con especial énfasis en el papel de la fosforilación en tirosina en las interacciones proteína/proteína y en la transmisión de señales activadoras al interior de las células. En nuestro laboratorio se han caracterizado algunas de las rutas señalizadoras que se activan tras la estimulación de CD38 o CD3 en linfocitos T. En la actualidad nuestro principal interés es comprender cómo estas moléculas se asocian con otros receptores de membrana, tirosina-quinasas, u otras moléculas señalizadoras. Para ello, se utilizan diversas técnicas, tanto de Biología Celular como de Bioquímica de Proteínas y de Biología Molecular. Entre ellas, el cultivo de líneas celulares, inmunoprecipitaciones, técnicas de Western-blot, ensayos in vitro de actividad quinasa, sistemas de reconstitución in vivo en células COS o linfocitos T (mediante transfecciones transitorias o estables de cDNAs que codifican moléculas señalizadoras y/o receptores de membrana), expresión de proteínas de fusión en bacterias, sistema de los dos híbridos, sistemas de genes reporteros y animales transgénicos.