Ingeniería metabólica

Enrique Iáñez Pareja

Instituto de Biotecnología

Universidad de Granada

ÍNDICE:

1.        Introducción

2.        Ejemplos de ingeniería metabólica tradicional

2.1            Reducción de acetato en E. coli para lograr gran producción de proteínas recombinantes

2.2            Ingeniería metabólica en bacterias del ácido láctico

2.2.1                Inactivación de la LDH

2.2.2                Oxidación de NADH

2.2.3                Producción de diacetilo

2.2.4                Producción de alanina

3.        Ingeniería metabólica genómica y sus aplicaciones

3.1            Genómica

3.2            Análisis de flujo metabólico

3.3            Ejemplos de aplicaciones de análisis de balance de flujo

3.3.1                Deleciones génicas

3.3.2                Penicillium chrysogenum

4.        Herramientas genéticas

4.1            Vectores

4.2            Promotores

1.    Introducción

Definición de ingeniería metabólica:

bulletManipulación de los procesos metabólicos mediante tecnología recombinante con el objetivo de mejorar las propiedades de los microorganismos.
bulletMejora dirigida de las propiedades celulares mediante I.G. para modificar o introducir nuevas reacciones bioquímicas específicas.
bulletAlteración racional y dirigida de las rutas metabólicas de un organismo para mejor comprender y utilizar las rutas celulares en transformaciones (conversiones), transducción de energía y ensamblaje supramolecular.

Es un campo interdisciplinario que usa principios y técnicas de varios ámbitos: ciencias computacionales, genética, bioquímica, ciencia de los sistemas, biología celular y molecular, ingeniería bioquímica. El interés estriba en redirigir los flujos metabólicos para objetivos industriales y médicos.

bulletIncrementar productividad del proceso (ej., producción de antibióticos)
bulletIncrementar la producción de precursores biosintéticos o polímeros
bulletAmpliar capacidades metabólicas añadiendo actividades extrínsecas.

Hasta hace poco, esto se hacía de modo empírico, por ensayo y error (rondas sucesivas de mutagénesis y rastreo o selección de mutantes).

2.    Ejemplos de ingeniería metabólica tradicional

2.1           Reducción de acetato en E. coli para lograr gran producción de proteínas recombinantes

El problema técnico de la acumulación de acetato en cultivos densos de E. coli en los biorreactores, que tiene efectos negativos sobre la producción de proteínas recombinantes.

bulletUna aproximación obvia es la destrucción o eliminación de la porción de la ruta que conduce desde el nodo de acetil-CoA a la formación de acetato.
bulletOtro enfoque es un mejor control de la captación de fuente de C para reducir la acumulación de piruvato o acetil-CoA
bulletCreación de una nueva ruta que encaje en las rutas glucolíticas preexistentes introduciendo genes que codifiquen enzimas apropiadas.

Dos enfoques usados para modular la captación de glucosa:

bulletMetil-a-glucósido (MG), un análogo de la glucosa que entra por el mismo sistema PTS, no tóxico, metabólicamente inerte, inhibidor competitivo de la E-IIglc. La adición de MG redujo la acumulación de acetato en el fermentador.
bulletBasándose en estos estudios, se construyó una raza manipulada que tenía baja formación de acetato a través de la modificación de la tasa de captación de glucosa. La cepa tenía una mutación en el gen ptsG, que codifica la PEP:PTS. La producción de proteína recombinante aumentó 50%

Redirección del flujo de C hacia subproductos menos inhibitorios: expresión heteróloga del gen de la acetolactato sintasa (ALS) de B. subtilis, cuyo producto convierte piruvato en acetoína. Se escogió el punto de ramificación del piruvato debido a su posición central de punto de redirección de flujo. La expresión heteróloga de ALS modificó drásticamente los flujos glucolíticos: el nivel de acetato excretado se redujo drásticamente, siempre por debajo de su nivel tóxico, mientras que la acetoína es 50 veces menos tóxica. No se afectaron la tasa de crecimiento específica ni los rendimientos celulares.

Eliminación de enzimas críticas implicadas directamente en la formación de acetato, específicamente la  ruta acetato quinasa-fosfotransacetilasa (ack-pta). La destrucción de esta ruta originó bajos niveles de acetato a expensas de la aptitud celular, debido a que la ruta de la LDH a partir del piruvato se hace mucho más competitiva.

2.2           Ingeniería metabólica en bacterias del ácido láctico

Las BAL homofermentativas tienen un metabolismos relativamente sencillo enfocado a la rápida conversión de azúcar en láctico, y carente de muchas capacidades biosintéticas. Poseen un elaborado sistema proteolítico centrado en la rotura completa de proteínas en aminoácidos, que son captados u usados en biosíntesis. No hay casi solapamiento entre el catabolismo del C y el metabolismo biosintético del N, lo que las hace objetivos ideales de la ingeniería metabólica: cada metabolismo puede ser modificado sustancialmente sin influir en el otro en la medida en que no se altere la generación de energía ni la biosíntesis de material celular.

El metabolismos homofermentativo se caracteriza por altas tasas metabólicas, logradas principalmente por la muy alta actividad de LDH, que regenera NAD. Ha sido muy fácil redirigir los flujos metabólicos hacia la producción de otros metabolitos.

2.2.1        Inactivación de la LDH

Se sabe que ciertas condiciones se reduce la formación de láctico y aumenta la de ciertas sustancias, algunas de las cuales (acético, fórmico, acetoína, acetaldehido, diacetilo) contribuyen a las cualidades organolépeticas de las leches fermentadas:

bulletPoco metabolismo de azúcar, con sustratos como galactosa o limitación de azúcar
bulletAlta aireación

Estas condiciones provocan una baja actividad LDH o bajos niveles de NADH.

bulletEn Lactococcus lactis el gen ldh se inactivó por integración de plásmido. La cepa mutante tenía una fermentación mixta en anaerobiosis, produciendo acético, fórmico, acetoína y etanol, y una fermentación casi homoacetoínica en aerobiosis.
bulletAlgo parecido en Lactobacillus plantarum, aunque fue más complicado porque esta bacteria posee dos LDH (para D- y L-láctico)

En ambas bacterias la producción de etanol se mejoró más clonando los genes de Zymomonas mobilis, una bacteria muy eficiente en formación de etanol: la clonación de los genes pdc-adh (piruvato descarboxilasa y alcohol deshidrogenasa) en los mutantes ldh con LDH inactivada originó un 2% de etanol.

2.2.2        Oxidación de NADH

Superexpresión de NADH-oxidasa (NOX). Se clonó el gen nox de Streptococcus mutans bajo el control del promotor de nisA inducible por nisina en L. lactis, y la adición de cantidades subhinibitorias de nisina.

2.2.3        Producción de diacetilo

El aroma a mantequilla se debe al diacetilo, aunque se produce en pequeñas cantidades de modo natural. Hay un intermediario inestable, el a-acetolactato, que normalmente se convierte en acetoína (acetotolactato descarboxilasa, producto del gen ALDB). Se realizó un doble cambio: superexpresión del gen NOX (para bajar nivles de LSD) y disrupción integrativa del gene ALDB. La cepa resultante convertía más del 50% del azúcar en diacetilo. Esto es un buen ejemplo de cómo convertir BAL en factorías de compuestos para alimentación.

2.2.4        Producción de alanina

Superexpresión de alanina deshidrogenasa de Bacillus sphaericus en L. lactis originó la producción de alanina dependiente de amonio a partir de azúcar. Cuando la clonación se hizo en un mutante ldh el resultado fue espectacular: más del 99,5% del azúcar se convirtió en alanina. Si además se deleciona el gen de la alanina racemasa, se puede lograr convertir a esta bacteria en fábrica de L-alanina, que se usa como potenciador del sabor.

3.    Ingeniería metabólica genómica y sus aplicaciones

Con la llegada de la I.G., se abre la perspectiva de hacerlo racionalmente y a voluntad, realizando cambios específicos en el genotipo que rindan fenotipos superiores previstos de antemano. Sin embargo, como dice Stephanopoulos, “existía una gran disparidad entre el poder de las herramientas genéticas actuales y la capacidad para analizar racionalmente las redes bioquímicas”. Desde comienzos de los años 90 toma cuerpo el nuevo enfoque de rediseño metabólico racional, estimulado por las aplicaciones comerciales potenciales y por el atractivo de sustituir procedimientos químicos por otros equivalentes biológicos.

El acercamiento ingenieril al análisis y diseño depende de tener un modelo matemático o computacional (simulador dinámico) del metabolismo, en la esperanza de que tal modelo se pueda usar luego en el diseño sistemático, por I.G., para lograr los cambios deseados. Tras los comienzos en los años 60, se llega en los 90 a la teoría de los sistemas bioquímicos (BST) y al análisis del control metabólico (MCA). Ambos métodos proporcionan cálculos sobre cómo los cambios en la concentración o en la actividad enzimática pueden llevar a cambios en los flujos metabólicos y en las concentraciones de metabolitos. Se ha visto que cambios sutiles en actividad de enzimas pueden lograr grandes cambios en los flujos. Igualmente se ha visto que las limitaciones de los flujos no suelen deberse a una sola enzima, lo que sugiere que las modificaciones genéticas deben ser amplias, incluso afectando a todos los genes de una ruta.

El deseo de tener modelos detallados dinámicos (cinéticos) del metabolismo elucidando el comportamiento sistémico de las redes metabólicas comienza a ser factible en la era postgenómica. Ahora tenemos la perspectiva de elaborar catálogos de partes de los componentes del metabolismo en razas concretas. A partir de esa información es posible reconstruir redes metabólicas a escala celular y recabar información sobre la estructura y estequiometría de la red y de sus reacciones. Se pueden pues construir modelos metabólicos a escala genómica.

La fisiología de las redes complejas como el metabolismo es una función de múltiples componentes que interaccionan. Por lo tanto, para comprender la función del metabolismo en tanto ligado a la fisiología celular global se necesita un enfoque holístico del estudio del metabolismo. Esa comprensión de la función sistémica de una red metabólica es obligatoria para el éxito del campo de la ingeniería metabólica.

El control del flujo metabólico es el objetivo primario de la ingeniería metabólica. El flujo metabólico se define como la tasa a la que el material se convierte vía reacciones y rutas metabólicas. Para ello debemos comprender los factores que influyen en el flujo. Una vez que uno entiende el flujo metabólico, se ha dado un paso hacia la comprensión del metabolismo celular, con lo que el ingeniero está en posición de alterar el genotipo de la célula en la esperanza de lograr el fenotipo deseado.

Objetivos:

  1. Aumentar la producción de metabolitos demasiado caros de obtener por síntesis química o para introducir una nueva capacidad.

  2. Organismos con nuevas capacidades catabólicas, de gran interés en aplicaciones ambientales o en microorganismos industriales que puedan crecer usando sustratos diferentes y más baratos para la obtención de vitaminas, aminoácidos, antibióticos, etc.

  3. Propiedades celulares que sean beneficiosas en el proceso industrial: evitación de productos tóxicos como el acetato y desvío hacia productos menos tóxicos (etanol, acetolactato). Escherichia coli con compuestos portadores de oxígeno, lo que le permite mejorar en condiciones de limitación de oxígeno.

La ingeniería metabólica ya se hacía, pero se han logrado resultados inesperados cuando las enzimas se sobreexpresan o se reprimen. Lo impredecible de la respuesta metabólica a las alteraciones genéticas se debe a la naturaleza multigénica de la función metabólica. Por lo tanto, no basta entender la función de una enzima o de una ruta aislada para describir la respuesta holística del sistema al cambio genético. Por lo tanto, para que la ingeniería metabólica se beneficie de la I.G. hace falta comprender las funciones multigénicas, y para ello necesitamos la genómica.

3.1           Genómica

Tras terminar un proyecto genoma, hay que identificar los genes o las ORFs, mediante:

bulletBúsqueda por contenido
bulletBúsqueda por señales
bulletMétodos integrados

Estamos a punto de obtener catálogos completos de componentes de muchos organismos. La genómica funcional debe llevar al uso de esa información para analizar interpretar y predecir las funciones celulares resultantes de su actividad coordinada. La acción coordinada de múltiples genes y proteínas se puede considerar como un “circuito genético”, que es el conjunto de diferentes productos génicos que se requieren conjuntamente para ejecutar una función particular. Para comprender la naturaleza sistémica de las funciones celulares, cada gen debe estudiarse en relación con su contribución a la función celular global.

Actualmente los microorganismos suministran los mejores modelos para establecer métodos in silico para analizar, interpretar u predicir las relaciones genotipo-fenotipo. Una vez que se han completado las asignaciones de ORFs a genes metabólicos, se puede construir el mapa metabólico completo que representa la estequiometría de todas las reacciones metabólicas que tienen lugar en la célula.

3.2           Análisis de flujo metabólico

Con el subconjunto de genes que codifican las enzimas metabólicas se puede construir una red de reacciones metabólicas. Se puede escribir un balance de flujo para cada metabolito, y con el tiempo, en el estado estacionario, los flujos se deben equilibrar para evitar una acumulación significativa del metabolito en la red. La estequiometría de todas las reacciones de la red se puede representar por una matriz estequiométrica

S·v = 0

bulletS es la matriz estequiométrica de m x n
bulletm es el número total de metabolitos
bulletn es el número de flujos metabólicos)
bulletv es el vector de n flujos metabólicos

Típicamente el sistema está indeterminado donde m>n. Pero bajo ciertas condiciones algunas rutas no son operativas y se pueden obviar. El sistema se puede hacer totalmente determinado o supradeterminado y se puede resolver junto con las medidas de los flujos externos o internos. Los métodos no invasivos de análisis, como la RMN pueden proporcionar también información sobre la estructura de la red.

Para determinar el estado metabólico hay que resolver esa ecuación para los flujos metabólicos (v), lo que entonces indicará el estado metabólico de la célula bajo las condiciones definidas. La matriz S es el componente clave del análisis de flujo, y se puede derivar de la información genómica.

El sistema indeterminado origina un rango infinito de soluciones a la ecuación, pero las reales residen en un subconjunto llamado el set factible. Este se puede definir como las capacidades del genotipo metabólico de un organismo, puesto que define todas las distribuciones de flujo que se pueden lograr con un juego particular de genes metabólicos. El uso particular del genotipo metabólico bajo unas condiciones concretas se puede definir como fenotipo metabólico desplegado en esas condiciones.

3.3           Ejemplos de aplicaciones de análisis de balance de flujo

Resumiendo lo visto hasta ahora: la genómica nos suministra información sobre la estructura y contenido de la red metabólica de un organismo. A su vez, esto nos sirve para generar una matriz estequiométrica, definida por la asignación de las ORFs. Entonces, el análisis de balance flujo se puede emplear para explorar la capacidades teóricas de producción y aptitud general del genotipo metabólico.

Ejemplos de objetivos:

bulletEliminación de una enzima o su inhibición para eliminar una ruta que compite con la de interés
bulletEliminación de un subproducto tóxico
bulletAmplificación de un gen o grupo de genes para mejorar la síntesis de un producto existente
bulletExpresión de enzimas heterólogas para para extender el rango de sustratos, para producur una nueva sustancia, para lograr rutas de degradación de compuestos tóxicos
bulletDesregulación de enzimas para relajar los mecanismos de control de un nodo rígido
bulletManipulación adicional de una ruta del metabolismo central para generar precursores, cofactores y energía necesarios para sostener a la ruta de interés modificada

Veamos algunas áreas de aplicación.

3.3.1        Deleciones génicas

El análisis de balance de flujo se puede emplear para interpretar y predecir los efectos fenotípicos de alteraciones en el genotipo, como las debidas a deleciones. Se puede hacer una predicción sobre si la deleción va a alterar negativamente la tasa de crecimiento o no va a tener influencia. La incapacidad de la red de absorber una alteración conduce inmediatamente a la requerimientos auxotróficos. Con ello podemos determinar los requerimientos auxotróficos que se necesitan en una cepa genéticamente alterada para encaminar los recursos metabólicos hacia rutas o reacciones particulares.

En un estudio in silico se investigó la relación entre el genotipo metabólico de cepas K.O. de E. coli y su fenotipo, recurriendo a todas las combinaciones posibles de deleciones sencillas, dobles y triples de los genes del metabolismo intermediario. Los productos génicos se clasificaron en varias categorías: esenciales, importantes, no esenciales y redundantes. Un buen número de genes parecían redundantes para el crecimiento en medio mínimo con glucosa. Los fenotipos previstos eran coherentes con los mutantes caracterizados experimentalmente.

Se puede investigar los cambios esperados en el enrutamiento metabólico cuando hay pérdida de función de un producto génico por deleciones génicas o por inhibición de su actividad. La red metabólica tiene la suficiente flexibilidad estequiométrica para redistribuir sus flujos metabólicos con pocos cambios en su capacidad para el aumento de biomasa, incluso cuando se pierden enzimas clave. Además, el análisis de flujo se puede usar para predecir los fenotipos metabólicos bajo difererentes condiciones de crecimiento, como sustrato o disponibilidad de oxígeno.

El análisis de flujo se puede combinar con técnicas recientes que examinan la expresión genética en una escala genómica. Aunque la relación entre el valor de flujo y los niveles de expresión génica es no linear, se puede obtener información cualitativa (on/off), así como la importancia relativa de los productos génicos bajo una determinada condición. Basándose en la magnitud de los flujos metabólicos, se pueden inferir evaluaciones cualitativas de la expresión génica. Estos se puede comparar con grupos de datos experimentales (arrays de oligonucleótidos). Ello se vio con la levadura: se observaron los cambios temporales en los perfiles de expresión génica durante el cambio diaúxico usando ESTs de todo el genoma.

3.3.2        Penicillium chrysogenum

Un modelo estequiométrico con este hongo consideró 61 flujos internos y la captación de glucosa, lactato, g-butirato y 21 aminoácidos. Puesto que se consideraron 49 metabolitos intracelulares y 82 flujos incluyendo tasas de captación, el número de grados de libertad fue 33. Se midieron 33 flujos, el mismo número que el de grados de libertad, incluyendo las tasas de captación de los sustratos mencionados y las tasas de formación de penicilina V y de 5 otros intermediarios clave. Se calculó el rendimiento máximo teórico de producción de penicilina para dos rutas diferentes de biosíntesis de cisteína, una por sulhidrilación directa y otra por transulfuración. El estudio propuso que un incremento de 20% del rendimiento teórico máximo de penicilina V sobre glucosa era posible si la cisteína se sintetizaba por sulfhidrilación directa en lugar de por transulfuración.

4.    Herramientas genéticas

Las herramientas genéticas ideales para la ingeniería metabólica deberían ser:

bulletPromotores fuertes y con un control estricto y consistente en todas las células. Los promotores inducibles deberían responder de modo lineal a la cantidad de inductor
bulletEl sistema de control genético debería poder regular la expresión simultánea de múltiples genes aunque a diferentes niveles
bulletEl vector debería mantenerse indefinidamente en el huésped en ausencia de una gran presión selectiva
bulletEl vector y el sistema genético de regulación asociado deberían imponer el mínimo de carga metabólica en ausencia de expresión génica

(Véase artículo para ampliar estas ideas)

4.1           Vectores

bulletDeberían tener estabilidad segregacional, al estilo de la que tienen los plásmidos F y P1
bulletDeberían tener un número mínimo pero consistente de copias en todas las células del cultivo. La consistencia la logran plásmidos como el F, cuya replicación está coordinada con el ciclo celular
bulletEl vector debe poder albergar grandes fragmentos de ADN para poder clonar rutas completas. De nuevo parece que los sistemas mejores son los derivados del plásmido F
bulletEncotrar vectores de amplio espectro de huéspedes

Se han diseñado vectores basados en el plásmido F. Tienen entre 1-5 copias por célula. Se ha construido un vector derivado de F, que presenta las siguientes características:

bullet9 kb de F con elementos necesarios para la replicación y la estabilidad segregacional:
bulletLos orígenes oriV, oriS aseguran replicación específica del ciclo celular,
bulletel locus de reparto permite ese reparto equitativo a células hijas,
bulletel gen repD recombina los dímeros hasta monómeros
bulletlos genes ccd matan cualquier segregante que pierda el plásmido
bulletGen bla para resistencia a ampicilina
bulletMódulo de clonación para la expresión:
bulletPromotor de araBAD y gen araC para una expresión inducible por arabinosa
bulletSitio de clonación múltiple
bulletTerminadores de transcripción

Este plásmido es estable en ausencia de presión selectiva, tiene una expresión génica bien controlada e impone una pequeña carga metabólica.

4.2           Promotores

bulletPara la mayoría de aplicaciones, necesitamos promotores fuertes y regulables
bulletEl nivel de expresión debería variar directamente y a ser posible linermente con la cantidad de inductor
bulletDebería de poder inducido uniformemente cuando se estimule

Desgraciadamente, los promotores investigados, especialmente el de lac, muestran respuestas del tipo “todo o nada”, que se piensa se deben al acoplamiento de la expresión del gen que codifica el transportador para el inductor. Esto supone una mayor carga metabólica para las células que expresan los genes. La solución lógica es desacoplar el control del gen del transportador respecto del control del inductor, o eliminar el gen del transportador del inductor y usar análogos del inductor (como el IPTG) que difunden fácilmente a través de la membrana.

En otro lugar hemos hablado de los promotores más usados (lac, araBAD), a los que hay que sumar el Pm de la ruta meta de los y Pu de la ruta upper de los plásmidos TOL de Pseudomonas.

En última instancia, la ingeniería metabólica tendrá que intentar la expresión de diferentes genes a partir de diferentes promotores, y de hecho ya hay varios ejemplos de esta estrategia.

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