INGENIERÍA DE PROTEÍNAS

 

PROGRAMA DE TEORÍA         PROGRAMA DE PRÁCTICAS             BIBLIOGRAFÍA

SISTEMA DE EVALUACIÓN        OBJETIVOS

 

PROGRAMA  DE TEORÍA

I. Introducción.

1.         Bases conceptuales y metodológicas del rediseño y modificación funcional de las proteínas. La cuestión básica: secuencias peptídicas y estructuras asociadas.

2.         Análisis estructural de péptidos y proteínas: revisión general de métodos difractométricos y espectrométricos.  Alcance y limitaciones de las diferentes técnicas empleadas.

3.            Plegamiento, estructura nativa y estabilidad de péptidos y proteínas: interacciones implicadas en la estabilización conformacional de las cadenas polipeptídicas. Modelos de plegamiento: criterios cinéticos y termodinámicos. Factores coadyuvantes del plegamiento.

II. Modelización y Diseño de Proteínas: Métodos Teóricos y Computacionales.

4.            Aplicación de métodos teóricos y computacionales al la modelización y al diseño de proteínas: introducción al problema. Bases de datos secuenciales y estructurales de proteínas. Acceso y utilización de PIR, SwissProt y Brookhaven Protein Data Bank: recursos telemáticos y metodología básica.

5.            Cartografía e infografía molecular de proteínas. Diagramación y proyección cartesiana de coordenadas atómicas. Determinación de ángulos y distancias. Definición de superficies: radios de Van der Waals, superficies accesibles y superficies de contacto. Descripciones numéricas y analíticas de superficies. Proyecciones en redes. Teselación. Mapas estéricos. Otros sistemas de representación.

6.            Hidrofobicidad. Perfiles hidrofóbicos y métodos de predicción y diseño basados en medidas de hidrofobicidad residual. Análisis topológico de proteínas integrales de membrana. Predicción y diseño de determinantes antigénicos. Análisis secuencial de flexibilidad. Diseño de secuencias "lider" y de canalización celular de proteínas recombinantes.

7.         Análisis de periodicidad estructural. Distribución axial de hidrofobicidad a lo largo de la secuencia y su significado topogénico: análisis predictivo de anfipatía axial. Momentos hidrofóbicos. Transformada de Fourier de perfiles hidrofóbicos. Diagramas de Stroud. Momentos de variabilidad.

8.         Análisis predictivo y diseño de elementos estructurales secundarios de proteínas: Conceptos y algoritmos básicos. Criterios de asignación de elementos secundarios en estructuras conocidas. Secuencias determinantes de patrones de plegamiento. diseño de elementos supersecundarios.

9.            Identificación y diseño de elementos estructurales y funcionales a partir de motivos secuenciales. Descripciones "lineales" de motivos secuenciales: PROSITE. Descripciones y métodos matriciales. Perfiles de Griskov. Concepto y medida de la "distancia" entre residuos isotópicos de secuencias homologas. La matriz de Dayhoff y otras matrices de distancia.

10.         Técnicas de alineamiento y análisis de homología entre secuencias polipeptídicas. Algoritmo de Needleman-Wunch. Indices de similaridad y parámetros relacionados. Generalización del algoritmo de Needleman-Wunch: alineamiento múltiple de proteínas. Dendrogramas y árboles filogenéticos.

11.            modelización estructural mediante homología. Técnicas de superposición estructural. Desviación cuadrática media entre Ca. Ajuste de regiones estructuralmente conservadas (SCRs). Asignación estructural de regiones variables.

12.         Análisis conformacional de proteínas: métodos variacionales de minimización de energía y mecánica molecular ("force-fields"). Métodos de convergencia para el cálculo de potenciales. Problemática de los factores entrópicos y la simulación del disolvente.

13.         Simulación dinámica molecular. Barreras conformacionales. Estrategias de calentamiento y equilibrado. Análisis combinado simulación dinámica-minimización. Compresibilidad.

14.            Metodología asociada al diseño racional de proteinas. Métodos heurísticos basados en datos previos ("knowledge-based"). Memorias asociativas y redes neuronales. Métodos de clasificación ("clustering")

15.       Diseño de ligandos y fármacos. Interacción proteína-ligando. Análisis conformacional de moléculas no enalzadas ("docking"). Métodos de evaluación estructura-función. QSAR.

III. Métodos Experimentales y Aplicaciones.

16.            Estrategias genéticas para la modificación y expresión de proteínas recombinantes: revisión de los métodos básicos de la ingeniería genética.

17.            Mutagénesis dirigida por oligonucleótidos. Métodos de selección "in vivo": "gapped duplex", "single primer", "coupled priming". Métodos de selección "in vitro": "Epstein". Métodos basados en el empleo de la PCR. Estrategias de mutagénesis sitemática: "cassete mutagénesis". Mutagénesis completa aleatoria.

18.            Vectores específicos para mutagénesis y secuenciación. Derivados de M13. FagJmidos. Vectores de expresión en procariotas : sistemas pET, pGEX y pMAL de E coli. Otros sistemas optimizados de expresión en procariotas.

19.            Estrategias de producción de proteína recombinante. Amplificación e inserción de fragmentos. Ajuste del marco de lectura. Proteínas quimJricas y de fusión. Proteínas nativas. Redireccionamiento ("targeting") y translocación de proteínas recombinantes. Secreción de proteínas recombinantes.

20.             Sistemas de expresión de alto rendimiento en procariotas. Optimización de promotores transcritos. Optimización de mensajeros. Purificación y estabilidad de proteínas recombinantes. Estabilidad de clones recombinantes. Producción a escala industrial.

21.             Vectores y estrategias de expresión en levadura. Promotores de levadura. Estabilidad de mensajeros y proteínas recombinantes. Redicreccionamiento y secreción de proteínas recombinantes en levadura.

22.             Expresión de alto rendimiento en eucariotas : sistema de expresión mediante baculovirus. Descripción del proceso infectivo. Vectores derivados de baculovirus: estructura y estrategias de expresión asociadas: transfección de células y de larvas de insecto. Modificaciones post-translacionales. Producción a escala industrial.

23.            Librerías combinatoriales de péptidos sintéticos: síntesis, barrido y verificación estructural. Librerías de exposición en fago ("phage display"). Descripción detallada de la técnica de “phage display” en vectores de M13. Estrategias de reconocimiento y selección (“panning”) de fagos recombinantes. Sistemas de evolución "in vitro" y librerías combinatoriales químicas. Aplicaciones al diseño de fármacos y enzimas sintéticos.

24.            Sistemas de transcripción y traslación "in vitro". Promotores empleados en la transcripción "in vitro" (SP6, T3, T6). Producción "in vitro" de mRNAs sintéticos. Traslación a partir de reticulocitos de conejo. Traslación a partir de extractos de germen de trigo.

25.       Síntesis química de genes. Métodos del fosfodiJster y del fosfotriJster. Síntesis de oligonucleótidos en fase sólida: método del fosfitotriJster. Dispositivos automáticos para la síntesis de oligonucleótidos. Estrategias de diseño de genes sintéticos.

26.       Síntesis química de péptidos bioactivos y proteínas. Inducción de plegamiento mediante restricciones estructurales. Estabilización funcional mediante enlaces disulfuro. Estudio detallado de algunas proteínas sintéticas: quimotripsina esterasa, linfoquina murina IL-3, otras.

27.       Diseño y modelización funcional de proteínas y enzimas. Rediseño de centros catalíticos y reguladores. Modificación de la especificidad catalítica de una enzima. Estudio detallado de algunos modelos experimentales: subtilisina, anticuerpos catalíticos, otros. Diseño "de novo" de nuevas proteinas y enzimas.

28.            Aplicaciones de la ingeniería de proteínas a la investigación básica. Análisis del plegamiento y de la estabilidad estructural y funcional de proteínas. Aplicación al estudio de mecanismos de catálisis enzimática. Estudio detallado de algunos ejemplos.

29.            Aplicación de la ingeniería de proteínas al diseño de fármacos y al desarrollo de terapias génicas e inmunotóxicas: Inmunotoxinas y citotoxinas dirigidas ("site-directed"). Otras aplicaciones al campo de la biomedicina, zootecnia, agricultura e industria.

 

 

PROGRAMA DE PRÁCTICAS

a) Métodos computacionales.- A lo largo de la asignatura se propondrán y resolverán, de manera sistemática, problemas y casos  prácticos de predicción estructural y diseño que tendrán que ser resueltos con ayuda del ordenador y del software específico en cada caso. Se prevée, para ello, la utilización, via red, de la infraestructura existente en el Centro de Informática de la Universidad de Granada, y el empleo tanto de software local como del existente en otros Centros y Servidores nacionales y europeos, en la medida en que puedan ser accedidos a través de Internet.

1.            Acceso, búsqueda y adquisición de datos estructurales del Brookhaven Protein Data Bank. Localización de servidores de datos via Internet. Búsqueda y adquisición de documentación y software específico sobre temas definidos.

2.            Infografía y cartografía molecular de proteínas con el programa RASMOL:

            2.1       Funciones básicas del programa y lenguaje de comandos. Identificación de estructuras y elementos secundarios. Localización de dominios y motivos estructurales.

            2.2.      Confección de "scripts" sencillos de tareas combinadas. Tratamiento y conversión de imágenes y comunicación con otros programas.

3.            Predicción estructural y análisis de homología: comparación de resultados entre diferentes algoritmos y programas (ProGraph, Multalin, ClustalV, Sybyl, Insight II, otros).

            3.1.      Obtención de perfiles hidrofóbicos. Identificación de proteínas integrales de membrana y predicción de su topología básica. Diseño de secuencias transmembrana.

            3.2.      Análisis de la estructura secundaria de proteínas modelo. Predicción y diseño de elementos secundarios.

            3.3.      Rastreo de bases de datos secuenciales a través de Internet. FASTA, TFASTA, BLAST, BLITZ. Identificación de secuencias relacionadas con una secuencia problema.

            3.4.      Alineamiento múltiple de una familia de secuencias. Comparación de diferentes algoritmos y elaboración del árbol filogenético.

            3.5.      Análisis de homología estructural entre secuencias mediante cálculo de la desviación cuadrática media entre C".

4.         Análisis estructural de un fragmento peptídico mediante mecánica molecular y/o simulación dinámica. Estudio del efecto de mutaciones puntuales. Caracterización estructural de familias de mutantes en el Brookhaven PDB.

5.            Desarrollo e implementación completa de un algoritmo básico: identificación de determinantes antigénicos mediante el procedimiento de Hoops y Wood. Valoración del método predictivo y diseño de un determinante antigénico sobre un "bundle" tetrahelicoidal sintético.

b) Métodos experimentales.- En función de las disponibilidades existentes, los alumnos realizarán un ciclo de sesiones experimentales en torno a uno de los siguientes tópicos propuestos: 

2.   Expresión de un marcador plasmídico en E. coli. Control de la expresión y efecto de los promotores empleados.

3.   Identificación, mediante inmunoprecipitación, de los productos de traslación "in vitro" a partir de reticulocitos de conejo.

4.   Mutagénesis dirigida por oligonucleótidos mediante el método de Eckstein: análisis de proteínas recombinantes.

 

 

BIBLIOGRAFÍA

1.-      Introduction to Protein Structure. C. Branden, J. Tooze (1991). Garland Publishing Inc. New York.

2.-      Proteins : Structures and Molecular Properties (2nd Edition). T. E. Creighton (1993). W. H. Freeman and Company. New York.

3.-      Methods in Enzimology Vol. 202 : Molecular Design and Modeling (part A : Proteins, Peptides and Enzymes). (1991) Academic Press Inc. New York.

4.-      Methods in Enzimology Vol. 183 : Molecular Evolution : Computer Analysis of Protein and Nucleic Acid Sequences. (1991) Academic Press Inc. New York.

5.-      Methods in Enzimology Vol.185: Gene Expression Technology.  Academic Press Inc. New York.

6.-      Molecular Mechanics. ACS Monograph 177. U. Burkert , N. L. Allinger. (1982) American Chemical Soc. Washington D.C.

7.-      Computational Chemistry : An emphasis on Practical Calculations. M. D : Johnston Jr. (1988). Elsevier. Amsterdam.

8.-      Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation. G.D. Fasman. (1990). Plenum Press. New York.

9.-      Protein Folding. T. E. Creighton. (1992) .W. H. Freeman and Company. New York

10.-      Análisis Vectorial (Sexta Edición). H. F. Davis, A. D. Snider (1992). McGraw-Hill. Madrid-New York.

11.-      Basic Microcomputer Models in Biology J. D. Spain (1982). Addison-Wesley Publishing Co. London.

12.-      Principles of Gene Manipulation (fifth Edition, reprinted). R. W. Old, S. B. Primrose (1995). Blackwell Science. Oxford.

13.-      Baculovirus Expression Vectors : A Laboratory Manual.D. R. O’Reilly, L. K. Miller, V. A. Luckow (1992). Freeman and Company. New York.

14.-      DNA Cloning 2. A Practical Approach. Core Techniques (Second Edition, reprinted). D. M. Glover and B. D. Hames eds. (1996). IRL Press. Oxford.

15.-      Protein Architecture : A Practical Approach. A. M. Lesk. (1990). Oxford.

16.-      Concept in Protein Engineering and Design. P. Wrede, G. Schneider. (1994). Walter de Gruyter, Berlin.

17.-   Combinatorial Libraries : Synthesis, Screening and application potential. R. Cortese. (1996). Walter de Gruyter, Berlin.

 

 

SISTEMA DE EVALUACIÓN

Los alumnos deberán resolver, a lo largo del curso, varias relaciones personalizadas de actividades que les serán propuestas periódicamente, en estrecha relación con los contenidos del programa. Para su resolución, los alumnos deberán localizar y consultar bibliografía especializada, resolver problemas numéricos, interpretar resultados experimentales, emplear programas de ordenador y recursos de red (Internet), elaborar diseños experimentales y redactar breves informes o revisiones bibliográficas sobre aspectos puntuales de la asignatura. La elaboración, con todo ello, del correspondiente cuaderno de actividades y su preceptiva presentación, al final del curso, constituirá la base de la evaluación de la asignatura.

 

 

OBJETIVOS

·      Introducir al alumno en el conocimiento de las bases conceptuales y metodológicas para el rediseño y la modificación funcional de proteínas recombinantes, así como su producción en sistemas experimentales de expresión adecuados.

·      Analizar con detalle algunos de los problemas centrales en el campo del denominado diseño racional de proteínas, haciendo especial hincapié en la utilidad, alcance y limitaciones de las principales técnicas biocomputacionales de predicción y modelización estructural de proteínas.

Familiarizar al alumno con las principales estrategias y sistemas experimentales de expresión de proteínas recombinantes en sistemas procariotas y eucariotas, así como en algunos de los avances metodológicos más significativos en el campo del diseño combinatorial de péptidos y proteínas y sus aplicaciones.